万古霉素抗药性肠球菌之筛检及实验室诊断----台湾感控

VRE之监测与环境采检

肠球菌为肠道之正常菌丛，因此粪便或直肠拭子均可做为VRE带原者筛检之检体。临床检体直接涂划于选择性培养基，于37℃培养。环境VRE筛检则以棉棒浸拭法(premoistened swab)采集检体，采检后将棉棒拭子置入非选择性增殖培养液(例如：brain heart infusion broth)中6-18小时后，次培养到选择性培养基中。VRE移生病人之筛检，则可用选择性培养基或选择性培养液来培养，亦可于培养基/液中加入6μg/mL vanco-mycin来提高检出率 [2]。一般针对VRE所用之选择性培养基可为：CAN blood agar plate with vancomycin、Campylobacter blood agar plate with vancomycin、Columbia CAN-Va 30 μg disc blood agar plate、Enterococcosel agar with vancomycin, 选择性培养液如： Enterococcosel broth with vancomycin；最后将选择性培养基上长出之vancomycin抗性菌株，再次接种于5% 血液培养基，并确认该菌株为革兰氏阳性球菌后再进行后续鉴定

VRE之监测与环境采检

肠球菌为肠道之正常菌丛，因此粪便或直肠拭子均可做为VRE带原者筛检之检体。临床检体直接涂划于选择性培养基，于37℃培养。环境VRE筛检则以棉棒浸拭法(premoistened swab)采集检体，采检后将棉棒拭子置入非选择性增殖培养液(例如：brain heart infusion broth)中6-18小时后，次培养到选择性培养基中。VRE移生病人之筛检，则可用选择性培养基或选择性培养液来培养，亦可于培养基/液中加入6μg/mL vanco-mycin来提高检出率 [2]。一般针对VRE所用之选择性培养基可为：CAN blood agar plate with vancomycin、Campylobacter blood agar plate with vancomycin、Columbia CAN-Va 30 μg disc blood agar plate、Enterococcosel agar with vancomycin, 选择性培养液如： Enterococcosel broth with vancomycin；最后将选择性培养基上长出之vancomycin抗性菌株，再次接种于5% 血液培养基，并确认该菌株为革兰氏阳性球菌后再进行后续鉴定。
肠球菌之鉴定流程

临床微生物实验室在肠球菌之菌种鉴定，基本上利用其生化学上之反应来测试，包括：革兰氏染色、PYR生成测试 (pyrrolidonyl arylamidase production test)、产色试验(pigment production test)、运动性试验 (motility test)、xylose快速发酵试验 (xylose rapid fermentation test)、arabinose 及 pyruvate发酵试验，其流程见图一及图二[1]；再依表一 [3]之反应结果确认肠球菌菌种。

肠球菌的色素检测 (pigment production)需以棉棒沾取菌落并于白色背景下观察是否有黄色 (bright yellow)出现，不可直接由培养皿观察菌落颜色。Motility test则将菌株置于0.5mL之BHI (brain heart infusion) 或 TSB (Tryptic soy broth)中，30℃培养2小时观察。xylose快速发酵试验之菌株浓度需达~90失3 McFarland标准浓度，以避免伪阴性结果之产生 [1]。

商用套组之鉴定系统亦可用于肠球菌之鉴定，包括Vitek 2 automatic system(BioMerieux, Vitej, Hazelwood, MO)、MicroScan POS 6 panel (Dade MicroScan Inc., Sacremento, CA)、API 20S Streptococcus and Rapid Strep strips (BioMerieux)，但偶会有鉴定错误的情形 [1]。基因分型法，如conventional multiplex PCR (m-PCR) protocol, real-time PCR (LightCycler system, Roche)，乃直接侦测 VRE抗药性基因的类别，可相对提高vancomycin抗性肠球菌鉴定之速度、特异性、及时效性[4]。


VRE之药物敏感性试验[/b]

肠球菌属对vancomycin之体外药物敏感性试验，以30μg之纸锭进行测试，所用培养基为Mueller-Hinton agar，菌液浓度为0.5 McFarland标准浓度 (可用生长期方式或直接调菌方式调配菌液)，置于35℃±2度之恒温培养箱中达24小时后 (其余纸锭培养16-18小时即可)，以透视光 (transmitted light)观察判读；抑制圈大小之判读标准为：≦14 mm、S (susceptible, 敏感性)；15-16 mm、I(Intermediate,中程度抗性)；≧17

mm、R(resistant, 抗性)，抑制圈中有薄膜状或菌落出现其结果均判读为抗性[5]。判读为中程度抗性之菌株，须依CLSI/NCCLS文件 (M100-S15)之标准方法 [5]，再次进行vancomycin抗性试验及MIC测试。(表一)

Vancomycin抗药性筛检试验

将菌落接种于含6 μg/mL van-comycin之BHI agar上，18及24小时均判读一次，长出菌株若鉴定为非E. casseliflavus及E. gallinarum之肠球菌则判定为VRE (表二)[5]。若菌株筛检结果为"nonsusceptibile"，则必须保留菌株，并送至可依NCCLS/CLSI标准进行菌种及药物敏感性试验之参考实验室进行确认。

要确认VRE之glycopeptide抗药性，可采用broth dilution test, agar dilution test(表三)，或Etest (ABB-IODISK, Solna, Sweden)。需注意的是须培养24小时后，才可判读vancomycin之MIC值；判读标准为：≦4 μg/mL、S(susceptible)；8-16μg/mL、I(intermediate)；≧32 μg/mL、R(resistant)。

讨　论

依美国疾病管制局标准作业准则[6]，必须对VRE病人采取适当的监测及防护政策；因此VRE监测培养结果之敏感性相对的会影响到管染管制政策执行之有效性。VRE(移生)病人之肠胃道是VRE院内传播之贮存窝，因此监测培养之检体来源可以为粪便检体或直肠拭子(rectalswab)；直肠拭子培养之敏感性虽比粪便培养来的低[7]，但基于采检时间点及便利性之考虑，一般仍以直肠拭子为主。研究报告[8]指出，直肠外围拭子(perirectal swab)在VRE肠道移生筛检之敏感性及特异性，与直肠拭子并无差异性，因

此对白血球低下病人或在病人采检舒适性的考虑上，也可以用直肠外围拭子送检。

环境筛检方面，由于VRE可在干燥的环境表面存活数天至数月[9]，因此VRE可能由具菌株传播能力之采检点，包括工作人员之衣服、器械、病人外围环境等分离出，例如：医护人员使用之携带式器械 (如：压脉带、止血带)、环境中之床栏、轮椅、血氧侦测器 (pulse oximeter)、门钮、床旁桌、布帘、电子耳温枪、治疗床等分离出[9]。以实际经验而言，monitor面版、病床遥控器、床栏、换药车台面、床上体重计之面布、床上磅秤垫子及按键、烤灯架、工作车、耳温枪、氧气筒架子之扶手及流量表旋钮等，都是环境VRE阳性采检点。因此在进行VRE环境筛检时，阳性个案之外围环境、邻近区环境及医护人员经常碰触之公用物，都是须考虑之采检点，以提供单位环境清洁消毒时之参考。

粪便检体约需具10 3 CFU/mL之VRE菌落浓度才能于直接涂划之培养基培养出[10]；但当带菌者之排出菌落数低时，则必须配合培养液(broth)之增菌作用来提高检出率[10]，否则GRE (glycopeptide-resistant

enterococci)的分离率会有低估之可能性。用于VRE筛检之培养基/液可以有多种选择，并可在选择性培养基/液中加入之vancomycin以增加VRE的筛检度，其添加浓度可由4到64μg/mL，虽然高浓度较易侦测出高程度的vancomycin抗性菌株同时可将E. casseliflavus及E. gallinarum排除，但因有的vanB-VRE菌株之MIC可低到4 μg/mL而可能因此被忽略，因此一般以加入6 μg/mL来将低程度glycopeptide抗性菌株侦测出。

病人肠胃道VRE移生筛检之培养通常约需48-72小时，甚至5天才能得知结果，报告发出时病人可能已经离院；利用PCR分析法可在8小时内侦测出vancomycin抗药性基因vanA及vanB[11]，研究结果显示在有VRE移生之病人，其后续以PCR分法侦测出阳性机率之敏感性比以直肠拭子培养高，报告时间也缩短[12]；而将直肠拭子接种入EV broth (enterococcosel enrichment broth with 8μg/mL vancomycin)， 再利用real-time multiplex PCR 分析法监测则可更提高VRE筛检之检出率[13]。

依美国疾病管制局标准作业准则，VRE隔离病人需在隔周连续三次检测筛检均为阴性时才可解除隔离。Karin等人依CDC准则针对116位VRE带菌者进行监测培养，连续五周监测培养结果之阴性比例分别为64%、92%、95%、100%、100%[14]，验证了CDC针对VRE病人解除接触性隔离之作业准则；Green等人研究中指出，粪便检体中之VRE浓度若>10 6 CFU/mL，可能与病人肠道VRE之持续性移生有关[15]，而VRE菌落密度低之粪便相对的在环境污染之效力也会降低[7]。但VRE病人追踪监测结果阴

性并不表示已将VRE由病人之肠胃道移除，只能代表菌落数降低到可侦测范围。一旦再度因抗生素使用抑制了正常菌株的竞争作用，此类病人仍会有VRE再次复发之可能。

结　论

检体VRE筛检所使用之培养基/液对检测结果之敏感性、特异性、人力及时间之花费上均有所差异，由于低程度vancomycin抗药性之肠球菌E. casseliflavus、E.gallinarum亦可由肠球菌之选择性培养基/液中分离出，因此临床实验室应建立临床检体与监测检体之VRE筛检方法，快速且正确的鉴定出E. faecium或E. faecalis之VRE菌株，才能有助于VRE感染管制政策之确实执行